Dvidešimt pirmasis mokslo populiarinimo konkurso darbas. Jo autorė – VU biochemijos krypties doktorantė Miglė Kazlauskienė. Ji rašo apie RNR nutildymą ir genų išraiškos stabdymą, nesunaikinant pačių genų. Skaitykite tekstą žemiau.
RNR nutildymas: kaip sustabdyti geną jo nepanaikinant
Miglė Kazlauskienė
Žmogaus ląstelėse, kaip ir daugumoje kitų, yra trijų svarbiausių rūšių biologinės molekulės: DNR, RNR ir baltymai. Dažnai yra kalbama apie baltymų pritaikymą biotechnologijos pramonėje, pastaraisiais metais padaugėjo kalbų apie genomo (DNR) redagavimą. Kiek mažiau dėmesio populiariojoje literatūroje susilaukia RNR, nors jinai taip pat turi savo pritaikymo sričių. Čia aptarsime dalį jų – kuo mums gali būti naudingas gebėjimas valdyti ląstelės RNR.
Truputis pagrindų
Pagrindiniai ląstelės darbininkai yra baltymai – jie dalyvauja įvairiose ląstelės medžiagų apykaitai svarbiose reakcijose, sudaro nemažai vidinių struktūrų, perduoda kai kuriuos signalus ląstelės viduje, perneša medžiagas iš arba į ląstelę bei atlieka visą eilę kitų funkcijų. Visa svarbiausia ląstelės informacija yra saugoma genome – vienoje ar keliose skirtingose dvigrandėse DNR molekulėse (priklausomai nuo organizmo). Šias DNR molekules galime suprasti kaip kelis originalius ląstelės taisyklių tomus, saugančius labai svarbią ląstelei informaciją (kaip gyventi, ką daryti), tačiau jose dauguma „taisyklių“ yra parašytos tik po vieną kartą. T.y., visoje ląstelėje egzistuoja tik viena „taisyklės“ kopija. Tuo tarpu ląstelėje darbuojasi apie 2 milijardus baltymų (1), kurių kiekvieną minutę pagaminami keli tūkstančiai (2) pagal genominėje DNR molekulėje užrašytą tinkamą „taisyklę“ (geną) ir kurių visų veiksmai yra taip pat reguliuojami pagal genominės DNR „taisykles“. Akivaizdu, kad ląstelėje tarp DNR ir baltymų turi egzistuoti tarpininkai. Pasiuntinukų funkciją čia atlieka RNR molekulės. Mažiau patvarios nei DNR, RNR molekulės tarnauja kaip taisyklių nuorašai: tam tikra viena „taisyklė“ yra nurašoma RNR molekulės pavidalu keliomis kopijomis, o jau pagal šias RNR molekules yra sintetinami baltymai. Yra ir kitų tipų ir paskirčių RNR: vienos jų atlieka reguliacines funkcijas, kitos, panašiai kaip baltymai, aktyviai dalyvauja kai kuriuose ląstelės procesuose.
DNR ir RNR sekos yra sudarytos iš vos keturių pagrindinių nukleotidų: A, G, T (RNR atveju U) ir C. Šias keturias „raides“ iš eilės galima jungtį į bet kokį „sakinį-taisyklę“. Ląstelėse yra įprasta, kad DNR yra sudaryta iš dviejų grandinių: nuo vienos grandinės galima perskaityti „taisyklę“ (yra baltymams reikalingi „skyrybos ženklai“ geno pradžioje ir pabaigoje, o kartais ir geno viduje), o antra grandinė yra svarbi apsaugoti pirmąją nuo pažeidimų. Antrosios grandinės seka nėra atsitiktinė, jinai atitinka pirmąją kaip dėlionės detalės (priešais A turi būti T, priešais G – C) ir jos pagrindu ląstelė gali išsitaisyti mutaciją pirmojoje grandinėje. Tokios dvi viena kitą atitinkančios grandinės yra vadinamos komplementariomis. RNR taip pat geba sudaryti dvigrandes struktūras analogišku principu, tačiau dauguma įprastų ląstelės RNR molekulių būna viengrandės, nes dėl jų trumpo „galiojimo laiko“ joms papildoma apsauga ir patikra nėra svarbi.
RNR nutildymas
2006 m. Nobelio premija fiziologijos ir medicinos srityje buvo paskirta A. Fire ir C. Mello už RNR nutildymo atradimą. Tai natūraliai ląstelėse vykstantis procesas, kurio metu visų pirma specialūs baltymai atpažįstą mažą dvigrandę RNR ir ją išardo, perduodami specialiam baltymų kompleksui tik vieną RNR grandinę. Ši surišta trumpa RNR tuomet gali susijungti su komplementariomis ląstelės RNR molekulėmis, susidarant vėlgi dvigrandei RNR. Vieni baltymai tokią surištą dvigrandę RNR perkerpa, taip sunaikindami atitinkamą seką turinčią ląstelės RNR, kiti laiko ją surišę, neleisdami prie jos prieiti kitiems ląstelės komponentams, taip neleisdami šiai RNR veikti. Abejais atvejais surišta ląstelės RNR nebegali atlikti savo funkcijos – yra nutildoma mažosios RNR. Kadangi ląstelės RNR-„auka“ pasirenkama pagal jos nukleotidų („raidžių“) seką, tokiu būdu yra nutildomos tik vieno tipo (ar vos kelių panašių tipų) ląstelės RNR molekulės.
Šiuo atrastu natūraliu procesu netruko pasinaudoti mokslininkai. Mažiems organizmams ar ląstelių kultūroms patiekdami sukonstruotas specialias mažas dvigrandes RNR, mokslininkai ištyrė, kas atsitinka šiems organizmams nutildžius vieną ar kitą jų ląstelių RNR, nešančią informaciją apie baltymo gamybą (3, 4). Tokių tyrimų dėka buvo sužinota, kurie baltymai yra svarbūs vieniems ar kitiems procesams: vystymuisi ar senėjimui, infekcijai ar vėžėjimui, kt. (5, 6) Jais remdamiesi kai kurie mokslininkai pasirinkdavo baltymus detaliems tyrimams, tikintis surasti vaistus, veikiančius pasirinktus procesus (pvz., vėžio ligos vystymąsi). Tokiu būdu buvo surasti ir jau naudojami vaistai nuo tuberkuliozės ir visa eilė įvairios paskirties vaistų, su kuriais šiuo metu yra vykdomi klinikiniai tyrimai (7). Bandoma vaistais paversti ir pačias trumpas dvigrandes RNR, kurios galėtų nutildyti žalingus genus. Tam tenka nemažai padirbėti pakuojant šias RNR į kapsules, kurios atsidarytų tik reikiamose ląstelėse – kitu atveju RNR kraujyje arba skrandyje yra akimirksniu sudegraduojama. Šiuo metu aktyviai vykdomi klinikiniai tyrimai, kuriuose tokiomis RNR bandoma gydyti tokias kepenų ligas kaip hepatitas B (8). Be to, RNR nutildymo technologija yra naudojama biotechnologijos pramonėje, išvedant specialias augalų linijas. Taip sukuriami augalai, atsparūs parazitams bei virusams, turintys mažiau toksinų, gaminantys daugiau maistinių medžiagų arba tiesiog turintys gražesnius lapų ar žiedų raštus, spalvas (9).
Keisti DNR ar RNR?
Daugiau besidomėję genomo redagavimu veikiausiai atkreipė dėmesį, kad nemažai sričių, kuriose yra bandoma taikyti genų redagavimą ir RNR nutildymą, persidengia tarpusavyje. Esminis skirtumas tarp šių dviejų technologijų – efekto stiprumas ir paveldimumas. Genų redagavimo metu yra keičiama genominės DNR seka, tad pakeitimai ląstelėje ir jos palikuonyse lieka visam laikui. Tai yra labai tinkamas būdas paveldimoms ligoms gydyti – toms, kurios atsiranda dėl esamų klaidų genominėje DNR (pvz., I tipo diabetas, Hantingtono liga). Toks DNR sekos pakeitimas taip pat pasižymi pilnu tikslinio baltymo panaikinimu ląstelėje: ištrynus reikiamą „taisyklę“ genominėje DNR, ląstelė nebežino kaip pagaminti atitinkamą baltymą. Tai yra palanku norint pilnai atsisakyti, pavyzdžiui, toksiško baltymo augalų linijoje. Tačiau kai kuriais atvejais ląstelės išgyvenimui gali būti svarbu, kad būtų bent nedidelis kiekis baltymo, kurio norima atsisakyti. Tokiu atveju tinka RNR nutildymas, kurį vykdant yra panaikinama didelė dalis (tačiau ne visos) informaciją apie tą baltymą nešančių RNR. Taip ląstelėje šis baltymas yra gaminamas, tačiau palyginti mažais kiekiais. Dėl šios priežasties RNR nutildymas labiau tinka ir patikrinti, kaip ląsteles paveiktų potencialus vaistas, slopinantis pasirinktą baltymą (10). Be to, šis metodas leidžia sumažinti pasirinkto baltymo kiekį norimu metu, prieš tai leidžiant ląstelėms išsivystyti. Taip pat ši technologija yra tinkamesnė gydyti infekcijoms ir ūminėms ligoms, pavyzdžiui, viruso baltymų RNR nutildyti (11). Tad nors RNR nutildymo ir genų redagavimo technologijos taikomos artimose srityse, abu šie metodai turi savo paskirtis.
Kitokie RNR nutildymo būdai
Tiesa, aprašytas RNR nutildymas taip pat turi trūkumų. Viena, neretai augaluose ir žinduoliuose jis sukelia ne laikiną efektą, o ilgalaikį, kuomet pateikta mažoji RNR yra įtraukiama į tam tikrus kitus ląstelės procesus (12). Nors tai yra tinkamas būdas sukurti stabilioms augalų linijoms, tačiau ne visada tinka tyrimams ar taikymams, kuriuose reikia laikino poveikio. Antra, panašu, kad RNR nutildymas pasižymi gana dažnais šalutiniais poveikiais ir kai kurios mažos RNR gali nutildyti visą eilę papildomų RNR. Be to, RNR nutildymas veikia daugiausiai ląstelės citoplazmoje, tad juo sunku paveikti tas ląstelės RNR, kurios veikia branduolyje (10).
Šias problemas gali išspręsti kiek naujesni RNR nutildymo metodai, paremti CRISPR-Cas sistemomis. Dabartiniais duomenimis, CRISPR-Cas sistemų baltymai pasižymi kur kas mažesniu pašaliniu poveikiu (10), be to, juos galima nukreipti į ląstelės branduolį. Yra dvi tokio pobūdžio strategijos. Vienoje jų yra pasitelkiamas modifikuotas Cas9 baltymas, kuriuo pagrįsta pastaraisiais metais plačiai aptariama genomo redagavimo technologija (13, 14). Baltymas yra modifikuotas taip, kad negalėtų kirpti DNR, tačiau vis dar galėtų prie jos prisijungti saugiai baltyme surištos mažos RNR dėka. Toks modifikuotas Cas9 gali būti nukreipiamas į geno pradžią, kur jis neleistų prieiti baltymams, norintiems nurašyti RNR (15). Tokį Cas9 taip pat galima „išjungti“ norimu laiku pridedant medžiagos, neleidžiančios jam jungtis prie DNR (16). Kita alternatyva – naudoti baltymų ir RNR kompleksą, vadinamą Csm arba Cmr. Šis baltymų kompleksas jungiasi tiesiai su tam tikrą seką turinčia ląstelės RNR ir ją sukarpo. Į komplekso sudėtį įeina maža RNR, kurios seką galime keisti; su ląstelės RNR-taikiniu ši maža RNR sudaro dvigrandę struktūrą, taip atpažindama tik tam tikrą seką turinčias RNR. Prie šios technologijos suradimo prisidėjo ir Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto mokslininkų grupelė, vadovaujama dr. Gintauto Tamulaičio ir prof. dr. Virginijaus Šikšnio (17). Šį kompleksą galima būtų panaudoti RNR sukarpymui ląstelėse kaip alternatyvą RNR nutildymui, o šiek tiek jį pakeitus – ir pasirinktos RNR vizualizacijai ląstelėje, su pasirinkta ląstelės RNR sąveikaujančių baltymų nustatymui ar įvairių veiksnių atvedimui prie RNR, taip didinant jų poveikį pasirinktai RNR molekulei.
Literatūra:
1. R. Milo. 2013. Bioessays, 35, 1050.
2. R. P. Milo, R., skaityta 2017, http://book.bionumbers.org/what-is-faster-transcription-or-translation/
3. R. S. Kamath ir kt. 2003. Nature, 421, 231.
4. L. M. Cullen, G. M. Arndt. 2005. Immunol Cell Biol, 83, 217.
5. A. Karlas ir kt. 2010. Nature, 463, 818.
6. S. E. Mohr, N. Perrimon. 2012. Wiley Interdiscip Rev RNA, 3, 145.
7. O. Perwitasari ir kt. 2013. Pharmaceuticals (Basel), 6, 124.
8. E. Bender, 2014, http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40871/title/The-Second-Coming-of-RNAi/
9. J. H. Sherman ir kt. 2015. Regul Toxicol Pharmacol, 73, 671.
10. M. Boettcher, M. T. McManus. 2015. Mol Cell, 58, 575.
11. U. Unniyampurath ir kt. 2016. Int J Mol Sci, 17, 291.
12. H. Kawasaki, K. Taira. 2004. Nature, 431, 211.
13. P. Grinkevičius, 2016, http://www.15min.lt/mokslasit/straipsnis/laboratorija/nobelio-premijos-vertas-virginijaus-siksnio-atradimas-gali-padeti-iveikti-ziv-ir-nepagydomas-ligas-650-603935
14. A. Kirėjevaitė, 2017, https://www.konstanta.lt/2017/01/populiariai-apie-genu-inzinerija-mokslo-populiarinimo-konkursas/
15. L. S. Qi ir kt. 2013. Cell, 152, 1173.
16. B. J. Rauch ir kt. 2016. Cell.
17. G. Tamulaitis ir kt. 2014. Mol Cell, 56, 506.
Kaip cia taip tiesiai ne apie „GMO“? :) Hmm, tiesa pasakius nelabai pamenu kokio ryskesnio mokslo populiarinimo straipsniuko apie RNR. Pavadinimas galetu buti labiau „catchy“. Bandymas isaiskinti sudetingesnius procesus bent kiek populiariau yra sveikintinas, taciau techniniu dalyku koncentracija islieka auksta. Cia visada dilema koks turi buti „mokslo“ ir „populiarinimo“ santykis. Mmm nuorodos i literaturos asltinius paciame texte, good good, man tinka, nors neaisku kiek to reikia pazintiniame straipsnelyje (nors vidinis, ryskiai saliskas, balsas putojasi kad reikiaa, ir techniniu detaliu, metodikos reikia ir rimtu literaturos saltiniu, ir IF). Dziugu, jog autore megina populiariai isdestyti siokius tkiu pagrindus, taciau visvien suprasti sudetinga (manau), beet turint omenyje temos sudetinguma nesugalvoju kaip dar paprasciau viska isdestyti, sunku kabinetis. Pati ideja idomi, kuomet nemodifikuojant rimtai motininio genomo galima zenklia itakoti genu raiska. Patiko ir privedimas prie praktikos ir darbu vykdomu musu krastuose (reikia gi pasidziaugti jog atradimai ne tik „kazkur kitur“ daromi). Paskutiniam paveiksliuke ten skirtingu spalvu juosteles tipo skirtingos plaukiojancios RNR lasteleje? keistai biski atrodo, bet gal ir ok. Straipsniukas gal kiek per ilgas ir apipintas sudetingomis savokomis, bet ko gero reikia ir tokiu ? Oh well, sunku sprest nes nuomone saliska gautusi.
Gal veliau sulauksime ir kokio straipsniuko apie transpozonu genu pernasa, piratavima ir alternatyvia „sleeping beauty“ istorija? :) (man cia tematiskai atrodo tiktu antram straipsniukui)
Pagrindai išdėstyti labai šauniai, tačiau apie patį RNR nutildymą papasakota gan suveltai, esmė pasimeta absoliučiai. Mano nuomone, reiktų mažiau mechanistinių detalių ir iš karto akcentuoti:
1) pasekmę: sunaikinama ar užblokuojama RNR – nebegaminamas geno produktas („nutildomos tik vieno tipo ląstelės RNR molekulės“ – taip paprastai neaišku, kokia biologinė šio fakto pasekmė, nepaisant gerai išdėstytų pagrindų).
2) principą: ląstelėje normaliai dvigrandė RNR taip paprastai neplaukioja. Kai tik komplementarus gabaliukas prilimpa ir padaro viengrandę RNR dvigrande – out.
Ir jei mechanizmas vis dėlto aiškinamas, kas ką suriša, žutbūt reikia paveiksliuko. Būtent čia, o ne straipsnio pabaigoje, iliustruojant kažkokias papildomas detales.
Bet toliau apie taikymus, palyginimą su genų redagavimu papasakota gerai. Ir jei kas pavargs skaitydamas ilgoką straipsnį, čia gali ir sustoti; o entuziastams liks dar papildomos informacijos pastraipa.